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闡明PCR引物的設(shè)計原則
引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計是否合理對于整個實驗有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。
引物設(shè)計原則包括:
1）、引物長度:一般為15～30 bp ，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。
2）、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去5～10度。
3）、3‘端要求：3’端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3’端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T。
4）、引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。
5）、引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個連續(xù)堿基互補(bǔ)，3’端不應(yīng)超過2個。
6）、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個的互補(bǔ)堿基存在。
7）、5’端無嚴(yán)格限制：5’末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點等）等等。
根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設(shè)置。
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