PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)說明

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)，應(yīng)用這一技術(shù)可以將微量目的基因（DNA片段）擴(kuò)增一百萬倍以上。PCR反應(yīng)理論的提出和技術(shù)的完善對于分子生物學(xué)的發(fā)展具有特殊的意義，它以敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡便等優(yōu)點(diǎn)迅速成為分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的方法之一，并使得很多以往無法解決的分子生物學(xué)研究難題得以解決。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：

1.預(yù)變性
模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。
2.變性步驟
循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過長損害酶活性，過短靶序列變性不*，易造成擴(kuò)增失敗。
3.引物退火
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
4.引物延伸
引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。
5.循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。
6.最后延伸
在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸*，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。