PCR反應DNA體外復制條件論述

       聚合酶鏈反應簡稱PCR(Polymerase Chain Reaction)，是以DNA半保留復制機制為基礎，發(fā)展出的體外酶促合成、擴增特定核酸片段的一種方法。PCR是一種非常強大的技術，可以通過一種非常簡單但是高效的方法來復制DNA，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。DNA復制是很多研究的基礎，例如，當我們對RNA進行測序時，必須先將RNA轉化為DNA，并進行大量復制。在對于某個人進行基因組測序時，我們不能對于某個細胞或者單個分子進行測序。測序的基礎要求擁有大量的相同的DNA分子拷貝，因此，DNA復制是做生物研究中的基礎工具。那么怎么獲取這么多拷貝呢？PCR正是一個復印機一般的存在，利用DNA的幾個特性，成為批量復制DNA的決佳方法。

       PCR原理是DNA分子兩條單鏈以雙螺旋結構結成，DNA兩條鏈擁有自行粘附的特性，A與T配對，C與G配對，DNA粘附特性是PCR的核心原理。同時DNA復制時也是具有方向性的，DNA序列的開始端稱為5‘端，末端稱為3’端。

      在復制時，需要加入一種叫做引物（primers）的東西。可以將引物理解為一個短序列，下圖中紅色的部分就是引物。引物通常15到20個堿基，可以短一些，也可以長一些。但是必須和我們想合成的DNA片段成互補關系。將引物與DNA鏈混合時，會自動粘在上面，因為他們是互補的。引物獲得可以從公司訂購，后續(xù)有機會我們也會分享引物設計方法。下面了解PCR反應DNA體外復制的所需條件如下：

一、模板和底物

DNA復制是模板依賴性的，必須以親代DNA鏈作為模板，親代DNA的兩股鏈解開后，可分別作為模板進行復制。同時，DNA復制需要以四種脫氧核糖核苷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，為底物合成子代DNA。
在體外進行DNA復制時，模板和底物均可通過人工添加解決。

二、引物

DNA聚合酶必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物，才能開始合成子代DNA鏈。

在體外進行DNA復制時，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作為引物，該引物序列與進行擴增的目的核酸片段互補匹配，從而開始目的片段的擴增。

因為引物的堿基序列需要與目的片段相匹配，在合成引物之前，必須首先已知目的片段的堿基序列，至少也要知道目的片段的部分序列，從而確定合成引物的堿基序列。

三、模板雙鏈的解旋

在DNA的半保留復制機制中，雙鏈DNA的解旋是在拓撲異構酶和解鏈酶的作用下完成的，該過程需要拓撲異構酶識別DNA的復制起點才能開啟，而體外擴增特定的核酸片段只需要特異性的復制目的核酸片段，因而需要一種方式使得模板DNA解旋為單鏈DNA，之后在使之與引物結合，從而特異性的擴增目的核酸片段。

三、DNA的變性

DNA變性是指核酸雙螺旋結構中堿基對的氫鍵斷裂，使得雙鏈變?yōu)閱捂湹倪^程。

對雙鏈DNA進行加熱可以使其發(fā)生變性，當溫度升高到一定高度時，DNA在260nm處的吸光度會突然發(fā)生明顯的上升，并達到最大值，之后溫度繼續(xù)上升，其吸光度也不會發(fā)生明顯變化，若以溫度對DNA溶液的260nm吸光度做圖，會得到典型的DNA變性S型曲線。

DNA的變性是在一個很窄的溫度范圍內發(fā)生的，通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達到最大值50%時的溫度稱為核酸的熔解溫度 (Tm, melting temperature)。

1. 特定核酸分子的Tm值與其G+C含量成正相關，GC% = (Tm-69.3) × 2.44；

2. Tm值的大小還與核酸分子的長度有關，核酸分子越長，Tm值越大；

3. 粒子強度越高，熔解溫度越高，熔解溫度范圍越窄。

四、DNA的復性

加熱變性的DNA在緩慢冷卻后可以由單鏈恢復為雙鏈結構，這一過程稱為DNA的復性，也稱為“退火 (annealing)"。

當溫度降低至比變性DNA的Tm低25℃時，其復性效果*佳，越遠離此溫度，復性效果越差。

因此，可以利用此特性，在加熱使模板DNA變性后，將溫度降低至特定溫度，從而使所加引物與模板DNA復性結合，進而能夠對引物所規(guī)定的核酸片段進行特異性的擴增。

五、DNA聚合酶

為了使模板中特定的核酸片段進行擴增，在模板與引物結合后，需要有DNA聚合酶的參與，但是由于DNA變性和復性過程的溫度較高，普通的DNA聚合酶在此過程中會由于溫度過高而失活。

科學家為了解決該問題，從水生棲熱菌 (Thermus Aquaticus) 中分離出了具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活。