ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中標(biāo)曲和樣本顯色過(guò)程探討

        ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。
       在檢測(cè)時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗原）與固相載體表面的抗體反應(yīng)。洗滌后加入酶標(biāo)記的抗體，通過(guò)反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。
      ELISA是免疫學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一。ELISA過(guò)程中常出現(xiàn)的各種問(wèn)題，下面淺析ELISA實(shí)驗(yàn)中標(biāo)曲和樣本顯色問(wèn)題：

一、標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色
溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時(shí)，未渦旋震蕩或不夠充分。標(biāo)準(zhǔn)品溶解時(shí)，需要渦旋震蕩，以保證充分溶解。在做倍比稀釋時(shí)，也要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打，效率較低、效果也不一定最佳。
二、標(biāo)曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某個(gè)組分，如檢測(cè)抗體、酶等。對(duì)于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。
三、標(biāo)曲顯色，樣本不顯色
遇到這種情況，很多人覺(jué)得是試劑盒問(wèn)題，這其實(shí)是一個(gè)誤區(qū)。任何一種實(shí)驗(yàn)方法，都有其局限性，當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng)，就無(wú)法檢測(cè)到。目前ELISA仍然是蛋白檢測(cè)靈敏度最高的方法，與不同技術(shù)結(jié)合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測(cè)靈敏度。如采用信號(hào)增強(qiáng)劑的高敏ELISA、ECL為底物的化學(xué)發(fā)光ELISA、采用熒光法檢測(cè)的ELISA、結(jié)合PCR擴(kuò)增的免疫PCR等等。
對(duì)于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測(cè)到樣本濃度，只能說(shuō)可以提高樣本的可測(cè)率，并使結(jié)果更加可靠。因?yàn)橥ǔＳ闷胀‥LISA檢測(cè)的樣本OD值都偏低，甚至低于標(biāo)準(zhǔn)品濃度最低的S7點(diǎn)，雖然可以計(jì)算得到數(shù)值，但實(shí)際上這個(gè)數(shù)值的可信度已經(jīng)降低了。而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。需要指出的是，國(guó)內(nèi)某些所謂的高敏ELISA試劑盒，并沒(méi)有采用信號(hào)增強(qiáng)劑的方法，而只是簡(jiǎn)單地提高了抗體濃度，較普通ELISA其靈敏度的提升有限。
還有人覺(jué)得，為什么用其它廠家的試劑盒可以測(cè)到樣本值，而我們的就是測(cè)不到呢？這里就涉及到回收率這個(gè)概念了，詳細(xì)的闡述下次有機(jī)會(huì)可以跟大家再聊一聊。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，回收率就是樣本的真實(shí)值和理論值之間的比值，優(yōu)秀試劑盒的這個(gè)數(shù)值在80 – 120%之間。與回收率相關(guān)的試劑就是試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。篩選出合適的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，使目的蛋白含量接近的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本顯色速度相似，那么計(jì)算得到的樣本值也會(huì)比較接近真實(shí)值。要想測(cè)到樣本值并不是很難，只要選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，壓低標(biāo)曲的本底，自然就會(huì)計(jì)算得到樣本值，然而這樣的樣本值并不真實(shí)，對(duì)于科研來(lái)說(shuō)沒(méi)有太大的參考意義。
四、標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大
這個(gè)問(wèn)題就跟移液器和實(shí)驗(yàn)者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范，就會(huì)造成移液的誤差較大。實(shí)驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對(duì)復(fù)孔的CV也有很大影響。大家可以參考關(guān)于移液器使用的文章，正確使用和維護(hù)移液器。個(gè)人的操作可以在空白板上練習(xí)移液動(dòng)作，或者在幾十個(gè)離心管中加入相同體積的水，通過(guò)電子天平稱量，檢驗(yàn)移液的精密度。同時(shí)還需練習(xí)加快加樣速度，減少?gòu)牡谝粋€(gè)樣本到最后一個(gè)樣本加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的差異。