在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，最后通過循環(huán)閾值( Cycle threshold，Ct) 和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

       PCR擴(kuò)增過程中，每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度。隨著反應(yīng)循環(huán)次數(shù)的不斷增加，所擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比。儀器實(shí)時(shí)檢測和采集的熒光信號(hào)，隨著時(shí)間和循環(huán)數(shù)的不斷增加，產(chǎn)生一條反映實(shí)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度變化的曲線，稱為擴(kuò)增曲線。

擴(kuò)增曲線以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)。樣本擴(kuò)增曲線是反應(yīng)PCR進(jìn)程的鏡子，我們可以通過觀察擴(kuò)增曲線來評(píng)估PCR擴(kuò)增效率，分析實(shí)驗(yàn)是否順利進(jìn)行。擴(kuò)增曲線的正常與否，反映出實(shí)驗(yàn)中存在的諸多因素和問題，對(duì)核酸檢測結(jié)果判讀十分重要。

 正常狀態(tài)擴(kuò)增曲線：正常PCR擴(kuò)增曲線呈“S”型，分為基線期、指數(shù)期、線性期、平臺(tái)期。擴(kuò)增曲線良好的指標(biāo)是曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平?性好，基線平??上揚(yáng)現(xiàn)象。

1、基線期

PCR起始時(shí)，剛開始前幾個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)還沒有發(fā)生變化，接近一條直線，將其稱之為基線，一般是3-15個(gè)循環(huán)。在基線期內(nèi)，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被背景熒光信號(hào)所掩蓋，無法判斷PCR產(chǎn)物量的變化。

2、指數(shù)期

擴(kuò)增的熒光信號(hào)高于背景熒光信號(hào)，擴(kuò)增曲線起峰，開始進(jìn)入指數(shù)期。在指數(shù)期內(nèi)，每個(gè)循環(huán)積聚的產(chǎn)物準(zhǔn)確加倍（假定100%反應(yīng)效率）。該階段的PCR反應(yīng)具有高度特異性和精確度。因?yàn)樗性噭┚渥?，反?yīng)的動(dòng)力學(xué)推動(dòng)反應(yīng)有利于擴(kuò)增子加倍，所以產(chǎn)物出現(xiàn)指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。只有在這個(gè)階段，Cq值與初始模板量的對(duì)數(shù)之間存在線性關(guān)系，所以在此階段進(jìn)行定量分析最合適。

3、線性期（高變異性）

隨著PCR反應(yīng)體系各成分的消耗，其中的一種或者多種成分限制反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)開始減緩，并且每個(gè)循環(huán)的PCR產(chǎn)物不再加倍，該階段不再是指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

4、平臺(tái)期

反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物，并且如果放置時(shí)間夠長，PCR產(chǎn)物將開始降解。因?yàn)槊總€(gè)樣品具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，所以每支試管或每個(gè)反應(yīng)將在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入平臺(tái)期，最終的產(chǎn)物含量也各不相同。

由于線性期和平臺(tái)期的擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的產(chǎn)物量與初始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以也不能通過這兩個(gè)階段的PCR產(chǎn)物量計(jì)算出初始模板量。想要知道初始模板量的多少，還要依賴指數(shù)期的Cq值進(jìn)行計(jì)算。

理論上，PCR每個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物量即增加一倍，擴(kuò)增曲線應(yīng)表現(xiàn)為熒光值隨著循環(huán)數(shù)增加而不斷上升。

實(shí)際上，擴(kuò)增曲線的熒光值并不會(huì)隨著循環(huán)數(shù)的增加而無限上升。這是由于PCR擴(kuò)增進(jìn)行到一定階段，反應(yīng)體系中的原料發(fā)生消耗和變性，如dNTP和酶等原料相對(duì)于模板減少，同時(shí)酶活性逐漸達(dá)到飽和；引物二聚體和反應(yīng)亞產(chǎn)物（如焦磷酸）的產(chǎn)生也會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)；引物和已擴(kuò)增的DNA片段間的競爭等都會(huì)導(dǎo)致PCR的擴(kuò)增效率逐步降低，直至為0。因此，擴(kuò)增曲線表現(xiàn)為擴(kuò)增到一定的循環(huán)數(shù)后，熒光值不再隨著循環(huán)數(shù)發(fā)生變化，而是保持平坦，出現(xiàn)平臺(tái)期。