ELISA試驗出現(xiàn)“花板”現(xiàn)象探究

      酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay， ELISA)在生物實驗技術(shù)中，ELISA是一種非常常見的分析方法。其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。該實驗因其靈敏度較高，特異性較好，操作較簡單，可大批量操作而廣泛應(yīng)用于多種傳染性疾病的篩查工作中。而在進行ELISA實驗的過程中，有時會遇到一種被稱為“花板”的現(xiàn)象。

    “花板”現(xiàn)象，顧名思義，是指在進行ELISA實驗時，酶標板上的反應(yīng)孔出現(xiàn)了不均勻的顏色分布，使得孔內(nèi)的顏色看起來像是“花”一樣。所謂“花板”，就是空白、陰性、陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標本孔的OD值卻偏高，弱陽性結(jié)果較多。這一現(xiàn)象的出現(xiàn)，影響了實驗結(jié)果的準確性，往往是由于實驗過程中的某些操作不當或試劑的問題所導(dǎo)致的。對“花板”現(xiàn)象進行了分析和總結(jié)，認為花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過程也會導(dǎo)致。

1、花板原因大多在樣品
　　所謂“花板”，就是空白、陰陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標本孔的OD值卻偏高。之所以空白、對照及質(zhì)控結(jié)果正常而標本孔異常，是因為樣品本身的原因，大部分或全部標本孔的OD值偏高，很可能是因為樣品中某些共有的物質(zhì)非特異性的吸附于固相載體，而在實驗的過程中未被除去。

1.1、 待測血清中混有紅細胞或纖維蛋白原 這兩種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，實驗表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000 /min)和較長的離心時間(>10 min)之下，血液標本被充分地離心分離之后，使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時避免加入紅細胞和纖維蛋白，避免這兩種干擾物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響，就可避免“花板”情況。

1.2、 高IgG血癥 在實際工作中，筆者發(fā)現(xiàn)，檢測丙肝的實驗出現(xiàn)花板的情況較多，原因之一是因為目前國內(nèi)外的抗-HCV EIA試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測原理，間接法的一個重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG，IgG對聚苯乙烯有較強的吸附力，非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽性。

2、解決辦法主要在洗滌
　　聚苯乙烯因其具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA實驗的固相載體，聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，因此需要通過洗滌清除在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻決定著實驗的成敗。上述提到的血清中存在紅細胞或纖維蛋白原，可以在加樣前離心時得到控制，同樣也可以通過適當增加洗滌次數(shù)和浸泡時間減輕或避免對實驗結(jié)果的影響，同樣，對于血液存在的非特異性的IgG,實驗者很難在加樣時將其去除，那么解決的最佳時機就是洗滌過程。

ELISA在洗滌過程中需注意以下幾點：

(1) 、板要平整，尤其是在用洗板機洗板的過程中，往往是3排一起洗，如果板不平，就很可能造成洗液有殘留，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈，對實驗結(jié)果造成干擾。

(2) 、洗液溫度，實驗表明，洗液溫度也會影響洗板的干凈程度，尤其是冬天溫度過低時容易出現(xiàn)“花板”問題。因此，最好保持室溫在20℃-30℃。

(3) 、洗液要注滿孔，孔壁洗滌不干凈也易造成“花板”現(xiàn)象。

(4) 、洗液要新鮮配置，洗液要臨用前新鮮配制，放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或混濁，造成賭孔或花板。

(5)、洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時間過短也會造成由于洗板不凈而造成“花板”。

3、孵育時間過長也會造成“花板”
　　本實驗室曾有一段時間經(jīng)常出現(xiàn)丙肝檢測“花板”現(xiàn)象，究其原因是由于樣本較多，加樣后未及時放入孵育箱，反應(yīng)板在室溫呆的時間過長，即間接增加了孵育時間，導(dǎo)致孵育時間過長，蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體。因此，應(yīng)嚴格控制加樣時間，加樣后及時孵育，標本較多時可分批操作。
　　此外，有些廠家的試劑顯色液不穩(wěn)定，使用前容易變藍，如在實驗前不仔細檢查，很容易導(dǎo)致“花板”現(xiàn)象的發(fā)生，這也提醒實驗者應(yīng)使用新鮮的顯色液，大程度的保證實驗的準確性。
　　綜上所述，將ELISA“花板”現(xiàn)象總結(jié)為：花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過程也會導(dǎo)致。既然原因大多在樣品，那么在樣品交接時應(yīng)嚴格按照規(guī)定，無溶血，無凝血，足量，單個的溶血樣品雖不致造成“花板”，但血紅蛋白中的血紅素基團，具有類過氧化物的活性，在以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為標記酶的ELISA測定中，易在孵育過程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色，從而造成假陽性。洗滌是ELISA的關(guān)鍵步驟，充分有效的洗滌也是避免“花板”的有利措施。同樣，嚴格按照試劑說明孵育，使用新鮮的顯色液也是有效避免“花板”的保障。以上措施可以有效減少“花板”次數(shù)，從而提高檢測的特異性和準確性，更好的發(fā)揮ELISA的方法學(xué)優(yōu)勢。