細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程及傳代問(wèn)題解析

       由于培養(yǎng)皿的限制，細(xì)胞到達(dá)一定的密度之后它的生長(zhǎng)速度就會(huì)放緩，所以為了讓細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，保持細(xì)胞旺盛的分裂能力。這時(shí)候需要進(jìn)行細(xì)胞傳代！
       細(xì)胞培養(yǎng)的雷比較的多，我遇到過(guò)比較的情況。這里可以做慢慢的分析和討論！先把基本的細(xì)胞培養(yǎng)的步驟貼出來(lái)！需要注意的是，懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)是不一樣的。
貼壁細(xì)胞傳代:
1：對(duì)于貼壁細(xì)胞來(lái)說(shuō)，它需要把上清去掉，用1-2ML的PBS洗一下細(xì)胞，然后用槍吸去洗滌液，然后加入胰酶進(jìn)行細(xì)胞消化。（加入1-2ML的PBS， 我是會(huì)貼壁加入到培養(yǎng)皿的邊緣，不能直接對(duì)著細(xì)胞加入PBS，容易把細(xì)胞都吹起來(lái)。這一步的目的是為了去掉殘余的培養(yǎng)基的，殘余的培養(yǎng)基會(huì)含有血清和一些離子等，不利于接下來(lái)的消化。此外，常見(jiàn)的是0.25%的胰酶。一般根據(jù)細(xì)胞皿的大小加入胰酶，對(duì)于10cm的dish，我會(huì)加入1ml的胰酶。）
2：放到37攝氏度培養(yǎng)箱30s-1min（我這里處理的是293T細(xì)胞，不同的細(xì)胞的消化時(shí)間是不一樣的，需要具體的去查一查，如果消化的好的細(xì)胞是會(huì)呈現(xiàn)流沙狀態(tài)的，上下晃動(dòng)都會(huì)隨著移動(dòng)的。）
3：加入含有血清的培養(yǎng)液終止消化，用槍把培養(yǎng)液吹勻。（因?yàn)楹醒蹇梢越K止胰酶的消化反應(yīng)，用槍吹培養(yǎng)皿底是為了把殘留在底部的細(xì)胞吹起來(lái)）
4：轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中，離心，200g 5-10min(一般我是1000rpm離心3min)
5：去掉上清液，然后用PBS 重懸細(xì)胞，加入的PBS的量是10ML。再次離心，去掉上清。
6：加入適量的培養(yǎng)基，把細(xì)胞重懸，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿里面。放入到37攝氏度的5%的二氧化碳培養(yǎng)箱。
懸浮細(xì)胞傳代:
1：對(duì)于懸浮細(xì)胞，達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)聚集成團(tuán)塊，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶時(shí)培養(yǎng)基會(huì)變得渾濁。（GM12878非常典型，當(dāng)然了，有的細(xì)胞不會(huì)聚集成團(tuán)，比如說(shuō)K562）
2：可以用臺(tái)盼藍(lán)溶液+自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，確定細(xì)胞的密度，計(jì)算需要添加的培養(yǎng)基體積，將培養(yǎng)物稀釋至建議的接種密度。
3：一般是按比例稀釋一下培養(yǎng)基，然后繼續(xù)傳代。（我在傳K562的時(shí)候，是會(huì)1：4的比例去傳代，保證細(xì)胞密度在1M/ML以下，能達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞處于旺盛的分裂期）
4：把細(xì)胞放入到37℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中，進(jìn)行培養(yǎng)

傳代問(wèn)題解決方案:
1.傳代密度過(guò)高
一旦細(xì)胞養(yǎng)太久至融合度過(guò)高（>90%）才傳代，容易使細(xì)胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細(xì)胞時(shí)不易吹打成單顆細(xì)胞，即便再重新鋪盤(pán)傳代，細(xì)胞也無(wú)法回到原本的特性了。（如：?jiǎn)螌蛹?xì)胞，沒(méi)長(zhǎng)滿(mǎn)就發(fā)生堆疊現(xiàn)象）
解決方案:
盡量避免融合度過(guò)高，鏡下觀察融合度約達(dá)到80%即可傳代分盤(pán)。
細(xì)胞融合度：在細(xì)胞培養(yǎng)中指的是細(xì)胞在培養(yǎng)表面（培養(yǎng)皿/瓶）所占的比例。

2.傳代密度過(guò)低
哺乳動(dòng)物貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，若細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開(kāi)始傳代，在傳代接種細(xì)胞密度過(guò)低，細(xì)胞間距離太遠(yuǎn)，就無(wú)法在細(xì)胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號(hào)傳導(dǎo)并活化細(xì)胞；總體細(xì)胞量不足，分泌的生長(zhǎng)因子濃度會(huì)不足以產(chǎn)生利于生長(zhǎng)的微環(huán)境，以上皆會(huì)造成增殖速度遲緩或細(xì)胞死亡。
解決方案:
細(xì)胞傳代時(shí)，要進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保鋪盤(pán)的密度.