LIC克隆過程

LIC克隆法 通過T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切活性分別處理目的基因和載體的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生12nt的5'突出互補(bǔ)末端，利用突出的互補(bǔ)末端之間的退火進(jìn)行基因克隆。12nt為人為額外添加。 克隆過程： 1、用5'端帶有重疊序列的特異性引物分別擴(kuò)增目的DNA基因和載體，獲得帶有重疊序列的目的基因和線性化質(zhì)粒； 2、使用T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切酶活性分別消化PCR擴(kuò)增得到的目的基因和載體； 3、產(chǎn)生粘性末端后，添加某一成分dNTP，終止切割； 4、將帶有重疊序列的兩個片段進(jìn)行退火，就形成了帶有切口的環(huán)狀質(zhì)粒； 5、轉(zhuǎn)化后，大腸桿菌內(nèi)的修復(fù)機(jī)制修復(fù)損傷的DNA分子，經(jīng)過復(fù)制得到大量目的質(zhì)粒。