pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體

商品屬性：

產(chǎn)品名稱	規(guī)格	貨號
pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體	20T	BJ-PJ6642

商品介紹：

描述：pUC57 Simple 通用克隆載體采用了 TOPO 酶連接技術(shù)，載體預(yù)先偶聯(lián)上 TOPO 酶，當(dāng)加入 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物后，5 min 就可以完成連接反應(yīng)，連接陽性率高。pUC57 Simple 通用克隆載體消除了大部分的常用酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)亞克隆。該產(chǎn) 品適用于 Taq 酶擴(kuò)增的含“A”尾巴和高保真酶擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物的連接，載體含有氨芐青霉素抗性篩選標(biāo)記。 

注意：RTS DH5α 凍干感受態(tài)在未溶解狀態(tài)下，可于-20℃長期保存（>2 年），已經(jīng)溶解后，請-60℃以下保存（3 個(gè)月）。
主要特征
（1）快速連接，最快僅需 5min；（2）操作簡單，僅需加入載體和片段即可；（3）無需藍(lán)白斑篩選，陽性率高；（4）不包含
任何酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)亞克隆（5）平末端和 A 尾產(chǎn)物通用。
注意：引物不能磷酸化。
測序引物
正向測序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；
反向測序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；
操作步驟
1. PCR 產(chǎn)物的純化
1.1 PCR 擴(kuò)增完畢后，電泳檢測產(chǎn)物，如無非特異性擴(kuò)增、無引物二聚體、條帶單一明亮，則可采用 PCR 產(chǎn)物純化試劑
盒純化后用于連接。產(chǎn)物不經(jīng)純化也可以進(jìn)行連接，但效果稍差一些。
1.2 PCR 擴(kuò)增完畢后，電泳檢測產(chǎn)物，如有非特異性擴(kuò)增條帶或引物二聚體，則必須采用膠回收后用于連接。
1.3 PCR 擴(kuò)增模板來源于 Amp 抗性質(zhì)粒，則必須采用膠回收后用于連接。
2. PCR 用量和連接時(shí)間
PCR 產(chǎn)物大小 PCR 產(chǎn)物用量 載體用量 摩爾比 連接時(shí)間 陽性率
0.1~1kb 2～10ng 1 μl 1: 5~10 5～10min >95%
1~3kb 10～20ng 1 μl 1: 5~10 15～20min >90%
>3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85%
3. 連接反應(yīng)
向 0.2 ml EP 管中依次加入如下試劑
成 分 用 量
PCR 產(chǎn)物 0.5~4 μl （用量參考上表）
pUC57 Simple Vector 1 μl
加無菌水至總體積為 5 μl
輕輕吹打混合均勻后，室溫（25°C）孵育 5～30min，通常放置 10min。
關(guān)于 PCR 產(chǎn)物的用量說明：在 PCR 產(chǎn)物回收后（在無法進(jìn)行 NanoDrop 測定濃度的情況下），按照一般的經(jīng)驗(yàn)可估算產(chǎn)物
的用量，原則為：3 μl 回收產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后，可清晰判斷的情況下，使用 0.5~1 μl 回收產(chǎn)物（約 5~15 ng）進(jìn)行連
接即可?；厥债a(chǎn)物難以觀察的情況下使用 4 μl 回收產(chǎn)物（約 5~10 ng）進(jìn)行連接。使用過高量的 PCR 產(chǎn)物將會導(dǎo)致連接效
率低下，長斑數(shù)量和陽性率急劇下降。